RNApure Reagent

RNApure（TRIzol）是广谱型总RNA提取试剂。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。本试剂适用范围广泛，可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等 样品中提取总RNA。样品在RNApure中被充分裂解的同时能够***限度地保证RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液会分成三层：上层无色水相、中间层和下层红色有机相， RNA分布在上清层中。收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。提取的总 RNA完整性好，无蛋白和DNA污染，可用于各种分子生物学常规实验，如RT-PCR、 Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等。

自备试剂氯仿(新开封或提取 RNA 专用)、无水乙醇。操作步骤1．各种材料的处理1）植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在 RNApure中迅速研磨，每 30-50 mg 组织加入 1ml RNApure，涡旋混匀。注意：样品体积一般不要超过 RNApure 体积的 10%。2）动物组织：取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎，每 30-50mg 组织加入 1mlRNApure，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入 1ml RNApure 混匀。注意：样品体积一般不要超过 RNApure 体积的 10%。3）单层培养细胞：吸去培养液，可直接在培养板中加入适量 RNApure（每 10cm²面积需要 1ml RNApure），用取样器反复吹打使细胞裂解。也可用胰蛋白酶处理后，将细胞溶液转移至 Rnase-free 的离心管中，13000×g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清，加入 1ml RNApure 混匀。注意：a. 收集细胞数量不要超过 1×10⁷。b. RNApure 加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果 RNApure 加量不足，可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污染。c. 收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不全，造成 RNA 的产量降低。4）细胞悬液：离心收集细胞。每 5×10⁶-1×10⁷动物、植物和酵母细胞或每 10⁷细菌细胞加入 1 ml RNApure。注意：a. 加入 RNApure 前不要洗涤细胞，以免 RNA 降解。b. 一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪或液氮研磨处理。5）血液处理：直接取新鲜的血液，加入 3 倍体积 RNApure（推荐 0.25ml 全血加入 0.75mlRNApure），充分振荡混匀。6）可选步骤：对于蛋白、脂肪、多糖或胞外物质含量高的样品，如肌肉组织、脂肪组织或植物的块茎，可以在匀浆处理后 4℃，13,000×g 离心 10 分钟以除去不溶物质，此时沉淀中含胞外物质、多糖和高分子量的 DNA，而 RNA 存在于上清中。2．样品中加入 RNApure 后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置 5 分钟，使蛋白核酸复合物*全分离。3．以每 1ml RNApure 加入 200ul 氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡 15 秒，室温放置 2 分钟。4．4℃ 13,000×g 离心 10 分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA 主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的 Rnase-free 离心管（自备）中。5．在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置 10 分钟。6．4℃ 12,000×g 离心10分钟，弃上清。7．加入75%乙醇（用Rnase-free Water配制）洗涤沉淀。每使用1ml RNApure用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤。8．4℃ 12,000×g 离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。9．室温放置 2-3 分钟，晾干。加入 30-100ul Rnase-free Water，充分溶解 RNA，得到的RNA 保存在-70℃，防止降解。注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。

适用范围:RNA 提取保存条件：2-8℃