NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒

NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：

NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5mL蒸馏水，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

• 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

• 将匀浆600g，4℃离心5min。

• 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。

• 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。

• 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定。

血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

（1）试剂四于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL试剂四和40μL试剂五，混匀，记录600nm处20s时吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

NOX活力单位的计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）NOX活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.25mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

1、血清（浆）NOX活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=5000×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.25mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。

上海牧荣生物科技有限公司

1. 国内试剂耗材经销代理。

2. 国外试剂的订购。可提供欧美实验室品牌的采购方案。

3. 提供加急物流处理，进口货物，最快交期1-2周。

4. 进出口货物代理服务。

5. 公司代理众多有名生命科学领域的研究试剂、仪器和实验室消耗品品牌：CELL DATA,Alamanda Polymers， cstti，Click Chemistry tools，Nanoprobes，Ancell，NANOCS，Ambeed, Inc，SPEED BioSystems, LLC，Tulip Biolabs, Inc，Torrey Pines Biolabs，magsphere ,FabGennix International ,paratechs，Medicago,Oraflow,CWE,Wasatch Photonics, alphananote, It4ip, proteoform, Caprico等,重点合作品牌 Lee Biosolutions,chematech,Nanopartz,denovix,Atto tec,macrocyclics等。

6. 质量保证，所有产品都提供售后服务。付款方式灵活。公司坚持“一站式"服务模式，为客户全面解决实验、生产、开发需求。公司整合国际与国内资源，加强网络建设，提高公司内部运作效率，为客户提供方便、快捷的服务。

7. 公司突出创新思维，提高工作效能，减低运作成本，为客户提供优惠的价格。

NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒