使用 LumiZol 试剂快速分离 RNA、DNA 和蛋白质

LumiZol Reagent 设计用于从各种来源（植物、动物、细菌和酵母）的细胞和组织样品中快速分离 RNA、DNA 和蛋白质。 LumiZol Reagent 是一种含有苯酚、异硫氰酸胍以及分离高质量核酸和蛋白质所需的其他成分的溶液。苯酚和异硫氰酸胍可裂解细胞并有效抑制核糖核酸酶，从而保持 RNA 完整。均质化并添加氯仿后，样品分离成上层水相、中间相和下层有机相。 RNA 可以用异丙醇从上相沉淀，而 DNA 和蛋白质可以分别用乙醇和异丙醇从中间相和下层有机相沉淀。

用于 RNA、DNA 和蛋白质分离的样品：

• 植物和动物组织——30-100毫克；

• 贴壁真核细胞 — 1×10 5至 1×10<sup7< sup="" style="box-sizing: border-box;">;

• 悬浮真核细胞、酵母 — 5×10 6至 10×10 6；

• 细菌细胞 — 1×10 7。

RNA分离

使用新鲜或液氮速冻样品以获得最佳 RNA 分离效果。在 LumiZol 试剂中均质化之前，请勿解冻样品。

1. 根据您的起始材料在 LumiZol 试剂中裂解样品：

• 组织：在 1 mL LumiZol 试剂中匀浆组织样本，并将匀浆转移至新的 1.5 mL 管中。

• 细胞：弃去培养基，用 0.5–1 mL LumiZol 试剂重悬细胞沉淀或单层细胞，然后将裂解物转移至新的 1.5 mL 试管中。

2. （可选）如果样品脂肪含量高，则将裂解液在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟，然后将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。

3. 将管在室温下孵育 5 分钟。

4. 向裂解液中添加 0.2 mL 氯仿（每 1 mL 用于裂解的 LumiZol 试剂），通过翻转管充分混合，并在室温下孵育 2 分钟。

5. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。离心后，混合物分成两相：无色水相和黄色有机相，其间有中间相。

6. 将上层水相转移至新的 1.5 mL 管中，不要接触间相。如果样品中RNA的量非常少，则在水相中添加共沉淀剂。保留有机相和界面用于 DNA 和蛋白质提取。

7. 向水相中加入0.8体积的异丙醇，充分混合，并在室温下孵育10分钟。

8. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。

9. 弃去上清液，向 RNA 沉淀中加入 1 mL 70% 乙醇，充分混匀，并在 4 °C 下以 7,500 × g离心管 5 分钟。

10. 弃去上清液，将 RNA 沉淀风干 5-10 分钟。

11. 将 RNA 沉淀溶解在 50–100 μL 无 RNase 水中。

DNA分离

1. 除去“RNA 分离"部分步骤 5 中获得的界面上的任何剩余水相。

2. 向界面相和有机相中添加 0.3 mL 100% 乙醇（每 1 mL 《RNA 分离》步骤 1 中使用的 LumiZol 试剂），通过翻转管混合，并在室温下孵育 2-3 分钟。

3. 将管在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。上清液可用于后续的蛋白质提取。

4. 将 DNA 沉淀重悬于 1 mL 柠檬酸钠/乙醇溶液（10% 乙醇中的 0.1 M 柠檬酸钠，pH 8.5）中。

5. 孵育 30 分钟，偶尔混合。

6. 将管在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

7. 再重复一次步骤 4-6。

8. 将 1 mL 70% 乙醇添加到 DNA 沉淀中，充分混匀，然后在 4 °C 下以 2,000 × g离心管 5 分钟。

9. 弃去上清液，将 DNA 沉淀风干 5-10 分钟。

10. 将 DNA 沉淀重悬于 0.3–0.6 mL 的 8 mM 氢氧化钠中。

11. 将管在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，并用 Tris-HCl 缓冲液将 pH 调节至 7–8 [添加 5 μL 1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 4.5）至300μL DNA溶液]。

蛋白质分离

1. 向《DNA 分离》部分第 3 步获得的上清液中添加 1.5 mL 异丙醇（每 1 mL 《RNA 分离》步骤 1 中使用的 LumiZol 试剂），通过翻转管充分混合，并孵育 10分钟在室温下。

2. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。丢弃上清液。

3. 将蛋白质沉淀重新悬浮在 2 mL 盐酸胍/乙醇溶液（0.3 M 盐酸胍于 95% 乙醇中）中。

4. 将管在室温下孵育 20 分钟。

5. 将管在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

6. 再重复步骤 3-5 两次。

7. 向蛋白沉淀中加入 2 mL 100% 乙醇，充分混匀，室温孵育 20 分钟。

8. 将管在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

9. 将蛋白质沉淀风干 5-10 分钟。

10. 将蛋白质沉淀溶解在含有 SDS 的缓冲液中（例如，用于将蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上的样品缓冲液）。