流式细胞分析方案主要步骤以及流式免疫检测

流式细胞分析方案主要分为4个步骤：  

• 样品制备：应通过机械分离方法或化学解离技术制备单细胞悬液，如采用酶溶液或钙螯合试剂。

• 封闭：通常采用抗Fc抗体稀释液悬浮细胞，防止一抗非特异性结合。

• 抗体孵育：流式细胞分析的孵育步骤涉及多种组分，包括一抗、二抗、链霉亲和素和荧光染料。

• 数据采集：大多数流式细胞仪都配备获取和转化细胞特征信号必需的软件。用户可根据自身实验要求设定具体的软件参数。

适当的对照

除了目标细胞之外，每次进行流式细胞实验还应包含以下对照：

• 至少一份未染色样品，与试样同时进行每一步的缓冲液孵育，以优化实验的流速和电压。

• 一份适当的阴性对照样品，与试样基本相同，但用在一抗的宿主种属中生产的同型对照替代试样中的一抗。该对照用于非特异性结合二抗。

• 如有需要也可准备一份已知表达所有目标抗原的细胞组成的阳性对照，并与试样共同孵育，但仅用单色检测。

流式免疫检测

同其他免疫检测应用一样，流式细胞分析也可通过多种方法利用抗体探测特定的细胞基元。两大常用方法为：直接检测法和间接检测法。

直接检测法

直接检测法是一种一步染色工艺，通过一抗特异性结合目标抗原，可直接结合支持成像或其他结合状态检测的分子。探测位于细胞表面的抗原时，不建议固定细胞，否则可能导致抗体探针无法接触目标抗原。因此，在数据采集结束前保持细胞活力十分重要。如要查找直接检测法的抗体，可采用Antibody Explorer抗体搜索工具，将Search Within（搜索范围）设为“Primary Antibodies Only"（仅限一抗），application（应用）选择“flow cytometry"（流式细胞分析）。

间接检测法

间接检测法先用纯化抗体与目标抗原孵育结合，再用荧光染料标记的二抗（特异性靶向一抗宿主同型）与一抗特异性结合，形成一抗-荧光二抗复合物。采用纯化一抗搭配各种波长（或颜色）的荧光染料标记二抗（特异性针对生产一抗的宿主同型）可提升抗体库的模块化程度。