Duolink® 邻位连接实验的样品选择与处理

一、样品选择

对样品和蛋白质靶标的已有了解十分重要。选择具有已知靶蛋白表达的系统将显著增加Duolink® PLA实验成功的几率。

Duolink® PLA实验所需的样本与用于传统免疫荧光 (IF)、免疫组织化学 (IHC) 或流式细胞术的样本相同。因此，Duolink® PLA试剂适用多种样品类型，包括：

1.贴壁细胞

2.悬浮细胞

3.血细胞

4.细胞离心涂片制剂

5.石蜡包埋细胞样品

6.石蜡包埋组织切片

7.冰冻组织切片

8.新鲜组织切片

在进行 Duolink® PLA 实验之前，必须对所有样品进行固定。对于流式细胞术应用，需要使用悬浮细胞。

选择读出方法：

Duolink® PLA产品提供了荧光和明场版本选择。荧光 Duolink® PLA 试剂可用于显微镜和流式细胞术应用。

选择读出方法的关键考虑因素是专用设备的可用性。荧光显微镜是 Duolink® PLA 实验常用的读出设备。上述所有样品类型均可与荧光Duolink® PLA 试剂一起使用，不过，部分样品会表现出明显的自发荧光。如果发生这种情况或当荧光仪器不可用时，可用光学显微镜进行明场Duolink® PLA实验。

流式细胞术方案对于仪器类型是不可知的（假设实验设计所需的合适滤光片可用），并且较易于适用于贴壁或悬浮细胞。

二、样品处理

样品应在固定、透化和抗原修复方面进行适当的处理。实验中所用一抗的条件优化对检测性能至关重要。

固定：

固定过程用于固定抗原，同时保留细胞和亚细胞结构。固定剂的选择可根据样品类型（细胞或组织）、一抗和蛋白靶标的不同而不同。不同的固定剂可影响一抗的抗原性，从而影响一抗的性能。如果所选一抗没有推荐固定方法，则必须由用户进行优化。

Duolink® PLA试剂与 IF 和 IHC 的所有常用固定剂兼容，包括：

1.丙酮

2.乙醇

3.甲醛

4.甲醇

5.多聚甲醛

6.锌

透化：

抗体进入细胞内表位需要透化作用。这通常是通过 Triton X-100、NP-40、Tween-20 或 digitonin等去垢剂来实现。有许多去垢剂可供选择——使用一种适合固定和所用样品的去垢剂。值得注意的是，一些固定剂（如丙酮和甲醇）也会引起透化，因此可能不需要额外的透化步骤。

抗原修复：

抗原修复用于显示在固定过程中被掩盖的抗原表位，从而允许抗体结合。抗原修复常用于福尔马林固定的石蜡包埋 (FFPE) 样品，但有时也用于悬浮固定的细胞。不同的抗原修复方法可能影响一抗的性能，因此必须由用户进行优化。

两种主要方法是热诱导抗原修复法 (HIER) 和酶诱导抗原修复法 (PIER)。Duolink® PLA 与 IHC 的常用抗原修复缓冲液兼容，包括：

HIER：Trilogy™、柠檬酸盐、EDTA 和高 pH Tris

PIER：用蛋白酶 K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理