大型共价连接荧光和金纳米粒子免疫探针

FluoroNanogold™ 探针含有荧光标记和与靶向分子共价连接的Nanogold®簇，已成功用于相关荧光和电子显微镜 (EM) [1]。然而，纳米金很小（1.4 nm），需要银或金增强才能可视化[2]。与较大的胶体金制剂相比，这会产生更大的尺寸变异性。银增强可能会导致非特异性背景；银可以通过四氧hua锇 (OsO ₄ ) 固定进行化学蚀刻，导致信号丢失[2]。我们已经制备了用于相关显微镜的共价连接组合荧光探针和较大的金纳米颗粒探针，可以通过电镜直接观察，无需自动金相增强。使用自组装涂层对直径为 2 nm 至 40 nm 的金纳米颗粒进行稳定和功能化，该涂层包含疏水性螯合硫醇结构域，用于将金表面与水介质密封，以及亲水性末端官能团（聚乙二醇，PEG），使金纳米颗粒具有生物相容性。金纳米粒子并实现位点特异性共价探针缀合。这提供了高稳定性以及表面特性和共轭反应的广泛选择。

5 nm 金纳米颗粒的制备方法是，在增溶性非官能化硫醇和受保护的胺官能化硫醇的混合物存在下，用硼氢hua钠直接还原金 (III) 盐水溶液，然后使用蔗糖密度梯度 (10-30%) 进行纯化超速离心（Ti-41 转子，26,000 rpm，45 分钟，5 ℃；距离顶部约 4 厘米的强烈红色带包含 5 nm 金）。通过在盐酸甲醇中脱保护制备胺功能化的金颗粒。通过与商业 N-羟基琥珀酰亚胺基-(NHS) Cy-5.5 荧光染料反应证明了特异性反应性。该缀合物通过 Superose-12 尺寸排阻色谱进一步纯化（图 1）。这种尺寸的不稳定颗粒会被 0.1 M 氯化钠沉淀，但即使在 1.0 M 氯化钠溶液中，涂覆的颗粒仍保持分散和悬浮状态。将它们反复离心并全重悬，不留下任何固体沉淀；对常规蛋白质或大分子稳定的胶体金缀合物进行相同的处理总是会导致部分组分损失，形成无法重悬的不溶性沉淀。

通过将 NHS 和马来酰亚胺活化的 5 nm 金颗粒分别与二抗分子 IgG 和 F(ab') 共价连接来制备组合 5 nm 金-二抗 -Alexa Fluor 594 缀合物。然后，NHS 修饰的 Alexa Fluor 594 染料与缀合物发生反应。使用蔗糖密度梯度超速离心纯化产物，然后如上所述进行凝胶过滤。使用抗兔-F(ab')缀合物作为针对多克隆兔抗红细胞抗体的二级探针来标记悬浮液中的绵羊红细胞，并使用 Nikon G-2A 滤光片组通过荧光显微镜观察标记情况（图2）。抗小鼠 IgG 缀合物用作二级探针，与小鼠抗人 AE1/AE3 初级探针一起使用，在人扁桃体组织中产生清晰的细胞角蛋白染色（图 3 ）。荧光金缀合物的相对量子产率为相应商业染料标记二抗的 22-35%。