DNA 标记方案——点击寡核苷酸和 DNA 的化学标记

点击化学是一种多功能反应，可用于合成各种缀合物。事实上，任何生物分子都可以使用点击化学方法轻松地用小分子标记，例如荧光染料、生物素等。

点击化学反应发生在两种组分之间： 叠氮化物和炔烃（末端乙炔）。叠氮基和炔基在天然生物分子中几乎从未遇到过。因此，该反应具有高度生物正交性和特异性。如果需要标记寡 核苷酸，可以在许多定制寡核苷酸合成设施和公司订购炔烃修饰的寡核苷酸。

1. 使用下表计算点击化学标记所需的试剂体积。准备所需的储备溶液（见附录）。

   试剂	混合物中的最终浓度	原液浓度
   炔烃修饰寡核苷酸	变化（20 — 200 uM）	各不相同
   叠氮化物	1.5 x（寡核苷酸浓度）	10 mM DMSO 溶液
   二甲基亚砜	50体积％	—
   抗坏血酸	0.5毫米	5 mM 水中
   铜-TBTA络合物	0.5毫米	10 mM，溶于 55 vol% DMSO

2. 将炔烃修饰的寡核苷酸或 DNA溶解在耐压小瓶中的水中。

3. 添加2M 醋酸三乙铵缓冲液（pH 7.0）至终浓度 0.2 M。

4. 添加DMSO，并涡旋。

5. 添加叠氮化物储备溶液（DMSO 中的 10 mM），并涡旋。

6. 将所需体积的 5mM 抗坏血酸储备溶液添加到混合物中，并短暂涡旋。

7. 通过向其中鼓泡惰性气体 30 秒来对溶液进行脱气。可以使用氮气、氩气或氦气。

8. 将所需量的 10 mM 铜 (II)-TBTA 库存在 55% DMSO 中添加到混合物中。用惰性气体冲洗小瓶并盖上盖子。

9. 涡旋混合物。如果观察到明显的叠氮化物沉淀，则将小瓶在 80°C 下加热 3 分钟，然后涡旋。

10. 在室温下保存过夜。

11. 用丙酮（对于寡核苷酸）或乙醇（对于 DNA）沉淀结合物。

    沉淀寡核苷酸缀合物：

    向混合物中添加至少 4 倍过量体积的 3% 高氯酸锂丙酮溶液（如果混合物体积很大，则分成几个小瓶）。

    沉淀 DNA 缀合物：

    向混合物中添加乙酸钠至终浓度0.3M；

    添加 2.5 体积的乙醇（或 0.8 体积的异丙醇）。

    充分混合并在-20°C下保持20分钟。

12. 10000 rpm 离心 10 分钟。

13. 丢弃上清液。

14. 用丙酮 (1 mL) 洗涤沉淀，以 10000 rpm 离心 10 分钟。

15. 弃去上清液，干燥沉淀，并通过 RP-HPLC 或 PAGE 纯化缀合物。