免疫细胞化学故障排除

故障排除

以下故障排除指南旨在解释免疫细胞化学/免疫荧光 (ICC/IF) 染色中观察到的常见问题的原因和可能的解决方案。

没信号

抗体应用

增加一抗或二抗的浓度或孵育时间。

透化缓冲液

• 使用适当的透化试剂进行靶蛋白的定位。 Triton 去污剂对于线粒体或核蛋白是必需的，但会溶解外膜并破坏正确的膜定位。

• 增加孵育时间或洗涤剂浓度。

细胞固定

• 过度固定可能会导致表位掩蔽。减少固定剂的时间或浓度。

抗体相容性

• 通过检查物种反应性来确认您的一抗和二抗是否兼容。

• 确认抗体可用于蛋白质处于天然构象的测定。

• 通过使用阳性对照初级滤光片，确保次级滤光片正常工作并与显微镜的滤光片组兼容。

目标可用性

• 使用已知表达目的蛋白的过表达测定或阳性对照细胞系。

细胞干燥

• 如果细胞干燥，荧光信号将会丢失。环盖玻片涂有指甲油。

细胞活力

• 在开始染色程序之前确认细胞活力。

显微镜调整

• 增加相机的曝光时间。

背景

抗体浓度

• 降低一抗/二抗的浓度。

阻塞

• 增加封闭缓冲液中的孵育时间或血清浓度。使用封闭缓冲液稀释一抗和二抗。

抗体应用

• 始终将一抗在 4° C 下孵育过夜。室温孵育会增加非特异性结合并导致更高的背景。

• 通过在没有初级的情况下进行测定，确认次级不会与细胞发生交叉反应。

污染文物

• 确保载玻片清洁且无灰尘。缓冲液应新鲜配制，以防止微生物污染。

洗涤

• 增加洗涤次数。对板进行非常温和的搅拌。

• 增加 PBS-T 中 Tween 的浓度。

光谱重叠

• 如果对细胞进行双重或三重标记，请确认二级细胞不会重叠到相同的光谱范围内