蛋白质印迹故障排除

故障排除

以下故障排除指南旨在解释蛋白质印迹中观察到的常见问题的原因和可能的解决方案。

Simple Western™ 可以克服传统蛋白质印迹法中需要排除故障的许多挑战，它可以在台式仪器内自动执行蛋白质印迹法的传统步骤。 Simple Western 使用毛细管电泳，消除了传统蛋白质印迹的凝胶到印迹转移，提供定量和可重复的结果。了解有关Bio-Techne 品牌 ProteinSimple 的Simple Western 仪器的更多信息。

无信号或信号弱

一抗浓度太低

• 增加一抗的浓度（滴定可能有帮助）。Novus 抗体浓度试剂盒可用于增加一抗浓度。

• 将孵育时间延长至 4°C 过夜

• 如果一抗重复使用次数过多，则有效抗体浓度可能太低；使用新鲜抗体来改善信号

目标蛋白浓度太低

• 每孔加载更多蛋白质（滴定可能有帮助）

• 使用已知表达目标蛋白的阳性对照裂解物、过表达裂解物或重组蛋白

• 确保裂解缓冲液是目标蛋白的最佳缓冲液；裂解缓冲液根据靶蛋白定位而有所不同。

• 如果需要增加非丰度蛋白质的浓度，请使用免疫沉淀或分级分离（即核分级分离）

• 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂

• 确保样品未降解

蛋白质从凝胶到膜的转移不成功

• 通过膜的丽春红染色或凝胶的考马斯染色确认蛋白质已成功转移到膜上。

• 通过分析加载控制表达式确认等量转移

一抗和二抗不兼容

• 确保二抗是针对产生一抗的物种而产生的

• （例如，如果一抗是在小鼠中产生的，则使用抗小鼠二抗）

膜选择不理想

• 检查抗原序列的疏水性/亲水性。 PVDF 膜可能更适合亲水性/极性/带电抗原，而硝酸纤维素膜可能更适合疏水性/非极性抗原

存在阻塞问题

• 封闭时间过长会掩盖某些表位并抑制抗体结合；减少封闭孵育时间或封闭液浓度

• 切换到不同的阻塞解决方案

膜冲洗过度

• 随着时间的推移，检测试剂可能会变得不活跃。确保试剂新鲜。二抗可以通过将其点在膜上并与检测试剂一起孵育印迹来进行测试。

• 处理低丰度蛋白质时，使用更灵敏的试剂（滴定可能有帮助；如果稀释，请使用高纯水）

图像曝光时间太短

• 增加曝光时间（多次检查以达到最佳曝光时间）

抗体仅识别天然蛋白质

• 如果使用仅识别天然蛋白质的抗体，请勿使用还原的变性蛋白质

目标是低分子量

• 减少传输时间以防止过度传输。对于小蛋白质以及孔径较小的膜（0.2 μm 与 0.45 μm），建议使用湿转法

发生叠氮hua钠污染

• 叠氮hua钠（通常用于储存一抗）会抑制 HRP 活性。确保充分洗涤以去除叠氮hua钠的存在或使用不含叠氮hua钠的缓冲液。

高均匀背景

阻挡不足

• 增加封闭时间和/或温度

• 增加封闭剂的浓度（尝试达到10%）

• 考虑更换封闭剂（牛奶与 BSA）

• 在抗体缓冲液中加入可选的封闭剂（也可以增加百分比）

阻止不兼容

• 对于磷酸化蛋白质的检测，不建议使用牛奶（牛奶和酪蛋白富含磷酸化蛋白质）

由于高抗体浓度导致非特异性结合

• 降低初级或次级的浓度（滴定可能有帮助）

• 在抗体缓冲液中加入封闭剂

• 通过执行二抗对照来确认二抗的特异性：省略一抗，仅将印迹与二抗一起孵育。

未结合的抗体洗涤不充分

• 增加洗涤次数和/或时间

干膜

• 确保在蛋白质印迹实验过程中膜永远不会变干

胶片曝光时间太长

• 降低曝光时间（可能需要测试一系列曝光时间）

检测试剂过于敏感

• 用纯水稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂

非特定条带/尺寸错误或多条带

目标蛋白丰度低于非特异性结合阈值

• 在 SDS-PAGE 凝胶中加载更多蛋白质

• 通过免疫沉淀或分级分离富集低丰度蛋白质

样品降解

• 使用新鲜裂解物

• 将样品放在冰上，直到样品缓冲液添加和沸腾之前

• 如果检测磷酸化靶标，则始终包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

可能存在其他蛋白质亚型

• 可能存在选择性剪接或多聚体形成。在这种情况下，可能需要异构体特异性抗体。

可能存在翻译后修饰

• 预测的分子量可能受到许多因素的影响，例如糖基化、磷酸化和蛋白质加工（从前体形式裂解为成熟形式）。为了确认特异性，进行阳性和阴性对照，例如重组蛋白或过表达裂解物、下调的敲低/敲除裂解物

有斑点或漩涡的背景

膜处理不当

• 尽量减少与膜的接触。使用干净的工具处理膜

缓冲液污染

• 制作新鲜的缓冲液

气泡

• 转移前滚平凝胶和膜之间的所有气泡

HRP聚合

• 使用 0.2 μm 过滤器过滤二抗以去除聚集物

洗涤不足

• 增加洗涤缓冲液的体积

• 增加洗涤次数和/或持续时间

其他事宜

白色/空心带

• ECL 底物消耗太快。降低一抗/二抗浓度或减少蛋白质用量

条带/泳道涂污（样品超载）

• 每个泳道中加载较少的蛋白质

分子量标记泳道为黑色

• 抗体可能与分子量标记发生反应

• 在分子量标记和第一个样品泳道之间添加空白泳道