大鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）测定试剂盒介绍

用    途：用于大鼠血清、血浆及相关液体样本中核因子κB受体活化因子配基（RANKL）测定。

工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中大鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）水平。向预先包被了大鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）单克隆抗体的酶标孔中加入大鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL），温育；温育后，加入生物素标记的抗核因子κB受体活化因子配基（RANKL）抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）的浓度呈正相关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材

1． 37℃恒温箱。

2． 标准规格酶标仪。

3． 精密移液器及一次性吸头

4． 蒸馏水，

5． 一次性试管

6． 吸水纸

注意事项

1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

4． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作程序

1. 标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)

2. 根据代测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3. 加样：1）空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗RANKL抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)；3）代测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗RANKL抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

7. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

操作程序总结：

操作程序总结：

1.准备试剂，样品和标准品

2.加入准备好的样品和标准品，生物素标记的二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟

3.洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟

4.加入终止液

5.10分钟内读OD值

6.计算

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。

2.批内与批间应分别小于9%和15%

检测范围：

检测范围：20 pmol/L -500 pmol/L

保存条件及有效期：

保存：2-8℃。

有效期：6个月(2-8℃)。