临床试验引起了科学界的关注，并激发了人们对 CAR 研究和开发的兴趣。因此，CAR 设计自诞生以来已经发生了巨大的发展，但其总体结构经受住了多次试验，并继续为 T 细胞疗法的开发提供有效的框架。

抗原结合域

与传统抗体类似，抗原结合域赋予 CAR 靶点特异性。因此，该结构域还决定了 CAR-T 细胞疗法的亲和力和亲和力，从而影响其疗效。传统上，CAR 的这一组件源自单克隆抗体的可变重链 (V H ) 和轻链 (VL )，通过接头结合形成单链可变片段 (scFv)。

这些 scFv 通常靶向癌细胞的膜结合表面受体，并导致主要组织相容性复合物 (MHC) 独立的 T 细胞激活。由于其在细胞激活中的作用，抗原亲和力必须足够高和选择性，但不足以诱导表达 CAR 的 T 细胞死亡。此外，研究还表明，对同一靶标具有相似亲和力的 CAR-T 细胞可能会导致截然不同的临床结果。这些差异可以通过癌细胞表面的表位位置和抗原密度等因素来解释。

抗原结合域开发的另一个重要考虑因素是scFv 聚集。 scFv 在强直信号传导（即以不依赖于抗原的方式进行信号传导）中发挥重要作用，因此，它们的过度聚集可导致高强直信号传导和随后的 T 细胞早期耗尽。聚集可能是由低折叠稳定性或 V H -V L界面处暴露的疏水残基引起的。限制这种效应使我开始对 T 细胞中 CAR 的表达水平进行精细控制。

简而言之，CAR-T细胞的最佳治疗效率始于在亲和力、表位特异性和CAR表达水平方面实现平衡。这反过来又凸显了在开发早期阶段需要进行广泛的 scFv 表征和工程设计。

铰链区

铰链区或间隔区是 CAR 的胞外结构，从抗原结合域延伸至跨膜域。该区域为 scFv 提供了灵活性，可用于增强对空间上无法接近的区域中目标表位的识别。

铰链设计，即长度和组成，也会影响 CAR 表达、信号传导和强度激活输出。最佳间隔长度取决于靶表位的位置和靶细胞上的空间位阻水平。例如，大量研究表明，长间隔区可以更好地接近近膜表位或糖基化抗原。相反，当靶向膜远端表位时，短铰链更有用。但实际上，间隔区长度需要针对每个特定的配体-scFv 对进行定制。与 scFv 对特定抗原的亲和力类似，长间隔区可以产生特别强烈的体内反应，但也会导致激活诱导的细胞死亡。

常用的铰链区源自膜结合受体（CD8 或 CD28）或 IgG（IgG1 或 IgG4）。然而，已知 IgG 衍生的间隔区与 Fcγ 受体 (FcγR) 相互作用，导致先天免疫反应激活和 CAR-T 细胞耗竭。因此，大多数 IgG 衍生的间隔区都会发生突变，以尽量减少与 FcγR 的相互作用。

除了在 CAR 信号传导中的作用外，铰链区还常用于在工程化后量化和纯化 T 细胞的 CAR 阳性子集。为此，当与 IgG 衍生的间隔区一起使用时，可以使用抗 Fc 抗体。此外，Strep标签序列已成功引入CAR间隔区，以确保更有效地定量和纯化CAR阳性细胞。

跨膜结构域

跨膜结构域将胞外 CAR 结构域锚定到 T 细胞膜上。与 CAR-T 细胞结构的其他模块相比，评估跨膜结构域的重要性和作用的文献要少得多。然而，最近的报告表明，该结构域的结构和组成可以改变表面表达水平并决定所表达的 CAR 的膜稳定性。跨膜结构域已被证明可以控制涉及CAR 组装、激活和聚类的其他关键反应。此外，已知该结构域会影响细胞因子的释放，如果过量，可能会导致高度的非特异性毒性。

作为一般规则，大多数 CAR 包含源自相邻铰链或信号传导结构域的同一蛋白质的跨膜序列。这些结构域大部分源自CD3z、CD4、CD8α 或 CD28，每个结构域都赋予 CAR-T 细胞截然不同的特性。例如，CD3δ衍生的跨膜结构域导致 CAR 掺入内源性 TCR（T 细胞受体）中，这通常伴随着 T 细胞激活的增加和复合物稳定性的降低。相比之下，CD8α 或 CD28 衍生的跨膜结构域显示出增强的膜稳定性。有必要更多地研究这些结构域对 CAR-T 稳定性和疗效的影响。

细胞内信号传导域

胞质内或胞内结构域是受体的功能末端。虽然胞外域（抗原结合域和间隔域）负责引导 T 细胞朝向特定靶点，而跨膜域将 CAR 锚定在膜上，但胞内域的作用是将信号传递至 T 细胞并启动信号级联。

然而，为了有效响应，共刺激信号对于维持级联至关重要。在绝大多数 FDA 批准的 CAR-T 细胞中，主要信号传导结构域通常源自 CD3z，而共刺激结构域（与 CD3z 相邻）源自 CD28 和 4-1BB (CD137)。其他共刺激信号，例如 ICOS、CD27、MYD88 加 CD40 和 OX40 也在临床前试验中证明了功效，但需要更多的研究来确定它们的体内功效。

共刺激结构域还决定T 细胞分化途径、代谢周期、细胞凋亡和激活诱导的细胞死亡。近年来，功能性细胞内信号传导域的研究在科学界中越来越重要，因此，优化其设计策略是确保功效的重要方法。