Nanogold® 偶联物分离方法

将凝胶过滤作为分离 Nanogold® 结合物的方法：这是我们实验室的常规使用方法，并且该方法已得到很好的表征。 Nanogold® 的分子量接近 15,000，但由于其中很大一部分是由非常致密的金原子组成的，因此在许多基于大小的分离技术（例如凝胶过滤）中，Nanogold 的表现就好像其 MW 更接近大约 8,000。

在计划您的标记反应时，您应该使用过量的成分，根据尺寸更容易与 Nanogold® 标记的产品分离。如果您的分子小于 Nanogold®，您应该使用过量的较小分子进行标记反应（对于稍小的分子，大约 5 倍过量是一个很好的起点，对于小得多的分子，10 倍到 20 倍是一个很好的起点分子），因为从反应混合物中分离过量的小分子比分离过量的大分子更容易。

如果您要标记大于约 10,000 MW 的分子，您应该使用过量的 Nanogold®，因为现在它比过量的未反应生物分子更容易与偶联物分离。对于大多数反应，两倍到五倍的过量是合适的。

凝胶过滤介质及其分离特性的列表在我们的 偶联物分离指南.

已经尝试了其他色谱方法，但迄今为止尚未给出可重现的结果。一种对十金有一定成功的方法是疏水相互作用色谱法，这种方法对十®金来说似乎很有希望。该方法的优点是可用于从纳米金偶联物中分离较大和较小的杂质;pocedure基于Hainfeld描述的undecagold，undecagold-Fab'共轭物和unlabelfab'的分离：

应该注意的是，使用的技术是疏水作用色谱，而不是反相;该方法依赖于离子强度递减的梯度，其中不同的固定化分子以不同的离子强度脱落。对于十一金和纳米金实验，都使用了丁基衍生化凝胶;还尝试了联苯衍生化凝胶，但丁基凝胶给出的结果最好。

使用三到六柱体积的梯度进行分离。将偶联物溶解在2.0 M硫酸铵中，使用乙酸三乙基铵（5 mM）将pH调节至中性值（7或7.5）。用于梯度的两个缓冲区是： （A）2M硫酸铵，使用三乙基乙酸铵（5mM）将pH调节至中性值（6.5，7或7.5）。 （B） 5 mM 三乙基乙酸铵，pH 7 或 7.5。 样品进样后，运行一体积的缓冲液A，然后在梯度上，缓冲液B的比例从0稳定增加到100%，然后用缓冲液B继续洗脱.使用该梯度，首先洗脱未偶联的Fab'，然后洗脱Nanogold-Fab'，然后是未连接的Nanogold。

我们不推荐将凝胶电泳作为纯化方法，因为 Nanogold® 颗粒在凝胶中的迁移是不可预测的，并且结合物的鉴定并不简单。透析的结果好坏参半；然而，应谨慎行事，因为某些膜含有可降解 Nanogold® 的成分。