荧光寿命的测定

吸收光后，分子在释放吸收的能量之前保持一定时间的电子激发态。在这里，不同的光化学过程以不同的概率相互竞争。除了无辐射失活外，还可以发射光，例如以荧光的形式。
之后激发分子数（n1）已降至1/e的系数（约37%），称为荧光寿命（τ佛罗里达州):

n1（t） = n1（0） e（- t / τ佛罗里达州)

有机染料的衰减行为可以用来识别它。然而，荧光寿命(荧光衰减时间)不是一个固定的量，而是受染料所处环境即溶剂和温度的影响。

ATTO染料 的荧光寿命通常在纳秒范围内（10 -9秒）。对于我们的目录，使用下述“时间相关单光子计数"方法确定 22 °C 水溶液（PBS，pH 7.4）中羧基衍生物的值。为此使用了来自HORIBA Jobin Yvon的使用寿命测量设备TemPro 。


时间相关单光子计数 （TCSPC）
激发后荧光光子的发射是一个统计过程。因此，单个分子保持激发态的持续时间也是一个统计量。然而，如果我们观察许多相同分子的集合，我们会得到一个定义明确的衰变统计量。
在当今常用的荧光寿命测量方法TCSPC方法中，这些统计数据的时间分辨非常好 - 低至皮秒范围（10-12 s） – 并以高检测灵敏度进行测量。为此，用周期性的极短光脉冲照射样品。激发后，样品发射荧光光子。测量第一个光子到达探测器之前的确切时间量。这些单个事件被计数，即作为“计数"输入直方图。随着这种单个实验的非常频繁的重复，最终通过加计数来获得样品衰变曲线的指数过程。

在每个激光脉冲和计数过程之后，必须重置测量电子设备。在此死区时间内无法记录任何光子。因此，以每 100 个激发脉冲仅检测到约 1 个光子的方式选择条件。否则，在较高的速率下，直方图中的短时间会被高估并且衰减曲线会扭曲（“堆积"）。实际上，测量通常以所谓的“时间反转"模式进行，即荧光光子开始时间测量，而由另一个二极管记录的激光脉冲停止时间测量。

在测量染料样品之前，应提供有关染料的以下信息：

• 吸收和荧光最大值，例如来自溶液或文献值的吸收和荧光光谱的测量。

• 荧光衰减时间的近似数量级，例如根据以前的测量、可比系统的测量或文献值估计。

光谱数据决定了激发光源的选择——如今通常使用强激光或半导体二极管——以及用于发射光谱选择的截止滤光片的选择。应选择此滤光片以防止散射的激发光到达检测器。

除了选择合适的激发光源和合适的边缘滤光片外，还必须遵守其他实验要求：

• 样品溶液在激发波长及以上的1cm比色皿中的吸光度应<0.1，以避免重吸收。例如，稀释溶液还可以防止由聚集和浓度缺失引起的问题。

• 散射样品溶液会导致评估期间意外缩短寿命的“出现"。例如，可以通过μ过滤样品溶液来避免这种情况。

• 通常，透明液体在 1 厘米荧光比色皿中以 90° 排列的方式测量。

• 检测时间窗口应足够长（至少 10000 个计数）。

在根据TCSPC原理进行荧光寿命测量的情况下，还需要确保计数率不超过脉冲激发光源重复率的2%。如上所述，这避免了所谓的“堆积"。

为了降低计数率，

• 稀释供试品溶液。

• 中性玻璃滤光片可以插入激发通道，从而降低激发光的强度。

• 可以将波长较长的边缘滤光片插入发射通道，从而减小检测到的荧光的光谱范围。

要将计数率提高到 2%，可以应用反向度量。

在测量荧光衰减时间时，还应测量散射溶液.dem例如0.01%Ludox AS40胶体二氧化硅溶液，以确定仪器功能，即电子器件的响应。这种参考测量的结果可以在以后的数据评估中考虑在内。

通过提供的软件进行数据分析。在这里，测量的数据点由曲线拟合。荧光衰变曲线的理论过程与放射性衰变一样，对应于一阶反应，因此是单指数的。但是，它也可能导致更高的指数曲线，以便更好地拟合测量点。例如，在一个溶液中存在具有不同荧光寿命的不同物种时，可能就是这种情况。

下图说明了一批 阿托 488 卡波西与 天宝装置。可以识别上述参数，例如检测时间窗口（峰计数>10000），使用Ludox溶液的参考测量/提示以及样品的测量。CHISQ = 1.1 且标准差均匀分布的双指数评估结果证明是最佳拟合的。荧光衰减时间 阿托 488 22 °C 水溶液 （PBS， pH 7.4） 中的羧基为 4.1 ns，该样品中的相对比例为 96.78 %。



软件中选择的补偿曲线的质量以及确定的荧光寿命的正确性等由参数χ2 （CHISQ，XSQ）和加权残差。
良好的契合度可以通过以下方式识别：

• χ 2 < 1.2 并且在添加另一个组件时没有显着变化（单指数 -> 双指数等）

• 加权残差的均匀分布，标准差

• 与以前的测量值或文献值一致

商业设备的供应商提供大量的手册和产品文档，通常详细描述相关设备的正确操作和所提供的软件。通过遵守给出的说明，例如，测量具有已知荧光衰减时间的染料，您将拥有必要的常规和经验来测量所用设备的“正确"寿命